Développements méthodologiques en spectrométrie de masse et en analyse protéomique pour la recherche de biomarqueurs de différents types de cancers PDF Download
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Author: Sarah Lennon
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Languages : fr
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Book Description
La protéomique clinique est, depuis ses débuts, considérée comme une technique à fort potentiel pour la recherche de biomarqueurs des cancers. Cependant, cette quête reste à ce jour sur un constat d'échec. Ces dix dernières années, la communauté protéomiste a œuvré pour comprendre l'origine des biais et pour homogénéiser les résultats. Les objectifs de mon travail de thèse s'articulent, dans ce contexte, en deux parties : - La première partie décrit l'ensemble des développements méthodologiques réalisés en analyse protéomique pour la recherche de biomarqueurs.- La seconde partie est consacrée à l'application de ces développements sur trois projets : (i) La recherche de biomarqueurs à visée diagnostique dans le but d'améliorer la caractérisation des lymphomes des cellules B. (ii) L'étude des cellules souches cancéreuses des glioblastomes. (iii) La recherche de biomarqueurs prédictifs des rechutes du système nerveux central dans le cas de lymphomes diffus à grandes cellules B.
Author: Sarah Lennon
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La protéomique clinique est, depuis ses débuts, considérée comme une technique à fort potentiel pour la recherche de biomarqueurs des cancers. Cependant, cette quête reste à ce jour sur un constat d'échec. Ces dix dernières années, la communauté protéomiste a œuvré pour comprendre l'origine des biais et pour homogénéiser les résultats. Les objectifs de mon travail de thèse s'articulent, dans ce contexte, en deux parties : - La première partie décrit l'ensemble des développements méthodologiques réalisés en analyse protéomique pour la recherche de biomarqueurs.- La seconde partie est consacrée à l'application de ces développements sur trois projets : (i) La recherche de biomarqueurs à visée diagnostique dans le but d'améliorer la caractérisation des lymphomes des cellules B. (ii) L'étude des cellules souches cancéreuses des glioblastomes. (iii) La recherche de biomarqueurs prédictifs des rechutes du système nerveux central dans le cas de lymphomes diffus à grandes cellules B.
Author: Guillaume Bechade
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Languages : fr
Pages : 247
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L’engouement autour de l’analyse protéomique par spectrométrie de masse a masqué des questions essentielles comme la qualité et la validation des résultats. Des difficultés majeures persistent pour identifier toutes les protéines d’un échantillon et en obtenir un recouvrement de séquence maximal. Actuellement, l’information recueillie est largement incomplète et incertaine. Les progrès à réaliser passent par l’amélioration des techniques séparatives, de la spectrométrie de masse, et des outils bioinformatiques de validation des données protéomiques. Dans ce contexte, ce travail de thèse s’est articulé autour de deux thématiques : ‣ Le développement de méthodologies pour améliorer l’analyse protéomique. Une étude de la répétabilité des analyses nanoLC-MS/MS d’échantillons protéiques complexes a conduit à la mise en place de solutions simples pour améliorer le nombre et la qualité des identifications. Ces innovations ont été appliquées à (1) la recherche de biomarqueurs spécifiques de leucémies au diagnostic ambigu ; (2) l’identification de partenaires d’interaction de facteurs de transcription suppresseurs de tumeur dans le foie. ‣ La mise au point d’approches pour la caractérisation de complexes protéiques covalents à liaison cystéine-cystéine. Des mesures de protéines entières par LC-MS haute résolution et l’analyse par nanoLC-MS/MS de dipeptides ont notamment permis l’étude de mécanismes rédox intracellulaires. Ces travaux, proposant une utilisation plus fine et fiable de la spectrométrie de masse, ont montré de manière univoque la pertinence de l’approche protéomique pour la découverte clinique, l’analyse fonctionnelle et l’étude de mécanismes enzymatiques.
Author: Luc Negroni
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Languages : fr
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L'analyse protéomique est une méthode de choix pour la recherche de biomarqueurs. Sans à priori, elle permet d'établir un catalogue de protéines qui sont exprimées dans une cellule, un tissu ou un organisme entier. Cette approche a été mise en œuvre pour une analyse protéomique de cellules coliques cancéreuses et une analyse phosphoprotéomique de biopsies hépatiques.L'étude de cellules coliques cancéreuses transformées par le gène cytosine désaminase et traitées par la prodrogue 5-fluorocytosine a été réalisée par électrophorèse bidimensionnelle des extraits protéiques. L'analyse d'image a permis la quantification de 353 protéines et isoformes dont 14 sont surexprimées et 4 sous exprimées lors d'un traitement par la prodrogue. Parmi les protéines dont l'expression est affectée par le traitement, l'HSP90 présente un niveau d'expression constant mais est identifiée sous deux formes qui diffèrent par leur pI. L'analyse par spectrométrie de masse à identifier une phosphorylation de ser 254 qui pourrait contribuer à la régression tumorale.Après avoir développé une méthode HPLC-TiO2 pour la purification de phosphopeptides, une analyse protéomique de 24 biopsies humaines provenant de carcinomes hépatocellulaires sur foie non fibreux (nf-CHC) et de tissus sains a été réalisée avec la technologie iTRAQ. Les peptides surexprimés dans les tumeurs correspondent à des protéines de choc thermiques, des protéines liées à l'ADN/ARN (histones, protéines du splicéosome), des protéines de la phase 1 de la détoxification (carboxyestérase, époxide hydrolase), les protéines du cytosquelette (actinine, tubuline), des protéines ou enzymes anti-oxydantes (superoxide dismutase, thiorédoxine). Les peptides sous-exprimés correspondent à des protéines du cycle de l'urée, de la détoxification (alcool déhydrogénase) du métabolisme des sucres, des lipides et des acides aminés. Dans la fraction TiO2, 19 phosphopeptides sont significativement surexprimés et 15 phosphopeptides sont significativement sous exprimés, mettant en en évidence une surreprésentation du motif -(S/T)P- parmi les phosphopeptides surexprimés dans les tumeurs. Une activation des proline directed kinases ou une inhibition des phosphatases correspondantes est donc probablement un événement caractéristique des nf-CHC. Ces peptides/protéines dérégulées sont autant de biomarqueurs potentiels pour le carcinome hépatocellulaire.
Author: K.D. Rodland
Publisher: IOS Press
ISBN: 9781586034610
Category : Medical
Languages : en
Pages : 56
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One of the major goals of twenty-first century medicine is the identification of biomarkers for the earliest possible stages of disease involvement so that prompt clinical intervention can limit damage, reverse pathological change, and ideally effect a complete cure. New developments in the analytical field of mass spectrometry are providing clinicians and translational scientists with even more powerful tools for the discovery of novel biomarkers. A key requirement for the successful application of mass spectrometric approaches to biomarker discovery is a clear reference standard for the 'normal' human proteome, and a better understanding of the sources and extent of 'normal' variability in human plasma proteins. This special issue of Disease Markers includes examples of biomarker discovery efforts directed at breast and prostate cancers, diabetes mellitus, and heart disease.
Author: Nadège Dossat
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Languages : fr
Pages : 394
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La protéomique est un outil essentiel dans la compréhension de maladies, tel que le cancer. Le profilage des protéines fournit une vue globale des processus de la maladie au niveau des protéines. la spectrométrie de masse SELDI-TOF est l'un des outils de laboratoire utilisés pour trouver les modèles protéiques associés à la maladie. un spectre de masse contient l'information sur les protéines et leurs fragments. Un pic c.-à-d. un maximum local du spectre de masse représente une protéine ou un fragment de proteine. L'objectif est de trouver des biomarqueurs discriminants, c.-à-d. des pics présents dans les groupes cancer du sein et témond sains mais avec des intensités spécifiques à chaque groupe ou encore des pics présents dans un seul des deux groupes. Le problème de cette technique de spectrométrie de masse est la variablilité sur l'abscisse (masse/charge) et sur l'ordonnée (intensité). La variabilité sur l'abscisse rend difficile l'identification des pics statistiquement "identiques" en abscisse. La variabilté sur l'ordonnée conduit à des problèmes de classification des spectres de masse. Un premier objectif était donc d'identifier les pics en tenant compte de la double variablité de ceux-ci. Le principe est de modéliser la variabilité des pics en abscisse et sur l'ordonnée par une distribution normale bivariée. Ainsi, la distribution de la totalité des spectres de masse par groupe (cancer/témoin) est modélisée par un mélange normal bivarié. L'estimation des paramétres de mélange de modèles est faite en employant l'algorithme EM contraint. Après cette identification des pics, les biomarqueurspeuvent être sélectionnés en utilisant des tests statistiques. Pour nous assurer de la réalité de la non présencede certains pics dans un seul des deux groupes, une améloration des méthodes de débruitage des spectres de masse par les transformés en ondulettes invariantes en translation a été étudiée. Le bruit des spectres est influencé par la matrice chimique utiliséé dans la technique de spectrométrie SELDI-TOF, ce qui donne un bruit avec une variance qui décroît continûment en fonction de l'abscisse. Cette deuxième partie a consisté à adapté le seuillage des coefficients d'ondelettes au bruit spécifique des spectres de masse SELDI-TOF. Des adaptations de l'algorrithme EM contraint sont alors nécessaires pour identifier de nouveaus pics par rapport aux groupes de méthodes développés dans la premire partie
Author: Adeline Page
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Languages : en
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La recherche de biomarqueur dans les fluides physiologiques est actuellement un axe de recherche en plein essor. L'identification de ces protéines est cruciale pour détecter plus précocement les maladies. Actuellement l'identification de protéine est effectuée à partir de la détection de leurs peptides obtenus après digestion enzymatique. Il est cependant difficile de détecter par cette méthode tant les modifications post-traductionnelles que les protéines de petite masse moléculaire présentes à faible concentration dans un mélange biologique complexe. Le développement de nouvelles méthodes sensibles permettant d'analyser ces protéines intactes est donc nécessaire. L'objectif de ce travail a donc été de développer une nouvelle méthode de détection de protéines entières basée sur un couplage nano-chromatographie liquide / spectrométrie de masse. L'utilisation d'une nanocolonne C4 montée sur la nanoLC couplée à un spectromètre de masse à trappe ionique permet de séparer et de détecter en ligne les protéines entières. L'acquisition en mode SIM (Selected Ion Monitoring) offre une meilleure sensibilité et spécificité de détection en sélectionnant trois ions multichargés caractéristiques de la protéine. La méthode développée a ensuite été appliquée pour détecter le NGF (Nerve Growth Factor), protéine neurotrophique de 13,5 kDa, qui est un marqueur potentiel du cancer du sein. Une limite de détection de 0,1 ng/mL a été atteinte pour détecter le NGF recombinant humain. Cette méthode a permis de détecter et doser le NGF dans la lignée cellulaire cancéreuse mammaire MCF-7, ce résultat a été confirmé par une analyse à haute résolution (FTICR-MS). L'étude de sérums a mis en évidence l'importance d'éliminer avant l'analyse les protéines de forte abondance. La déplétion des protéines majoritaires par immunoaffinité a permis d'analyser les échantillons de sérums de souris ou de patientes atteintes d'un cancer du sein, pour y détecter le NGF. Ces résultats montrent la possibilité d'utiliser le couplage nanoLC - spectrométrie de masse en protéine entière pour détecter un nouveau marqueur potentiel du cancer du sein. Cette méthode pourra être également appliquée à d'autres pathologies.
Author: Caroline Tokarski
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Languages : en
Pages : 245
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Book Description
D'orientation méthodologique, les travaux présentés dans ce manuscrit concernent principalement l'analyse des protéines ou des peptides d'échantillons biologiques natifs ou transformés par spectrométrie de masse FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) de très haute résolution. Ces études d'intérêt structural, mettent également à contribution les potentialités séparatives de l'électrophorèse mono ou bidimensionnelles et de la chromatographie liquide ainsi que les capacités d'intégration et de traitement des données offertes par l'outil bioinformatique. Ces travaux résultent à la fois de développements méthodologiques propres effectués au laboratoire et d'applications analytiques issues de plusieurs collaborations indépendantes. Ils m'ont permis d'explorer les différentes difficultés rencontrées lors des étapes clés de l'analyse des protéines ou autres macromolécules organiques complexes, et ainsi, de développer des outils et des méthodes analytiques appropriés à chacune d'entre elles. Une première partie de mes recherches porte sur le développement de nouveaux outils préparatifs en protéomique. Ainsi, l'utilisation de complexes de ruthénium porteur d'un ester actif a permis l'obtention de coloration protéique de grande sensibilité; le développement de nouveaux gels d'électrophorèse incorporant des monomères d'acrylamide N,N'-dialkylés a facilité la séparation de protéines très hydrophobes.
Author: Alisa G. Woods
Publisher: Springer
ISBN: 3319060686
Category : Science
Languages : en
Pages : 601
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Book Description
This volume explores the use of mass spectrometry for biomedical applications. Chapters focus on specific therapeutic areas such as oncology, infectious disease and psychiatry. Additional chapters focus on methodology as well as new technologies and instrumentation. This volume provides readers with a comprehensive and informative manual that will allow them to appreciate mass spectrometry and proteomic research but also to initiate and improve their own work. Thus the book acts as a technical guide but also a conceptual guide to the newest information in this exciting field. Mass spectrometry is the central tool used in proteomic research today and is rapidly becoming indispensable to the biomedical scientist. With the completion of the human genome project and the genomic revolution, the proteomic revolution has followed closely behind. Understanding the human proteome has become critical to basic and clinical biomedical research and holds the promise of providing comprehensive understanding of human physiological processes. In addition, proteomics and mass spectrometry are bringing unprecedented biomarker discovery and are helping to personalize medicine.
Author: Susmita Datta
Publisher: Springer
ISBN: 3319458094
Category : Medical
Languages : en
Pages : 294
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Book Description
This book presents an overview of computational and statistical design and analysis of mass spectrometry-based proteomics, metabolomics, and lipidomics data. This contributed volume provides an introduction to the special aspects of statistical design and analysis with mass spectrometry data for the new omic sciences. The text discusses common aspects of design and analysis between and across all (or most) forms of mass spectrometry, while also providing special examples of application with the most common forms of mass spectrometry. Also covered are applications of computational mass spectrometry not only in clinical study but also in the interpretation of omics data in plant biology studies. Omics research fields are expected to revolutionize biomolecular research by the ability to simultaneously profile many compounds within either patient blood, urine, tissue, or other biological samples. Mass spectrometry is one of the key analytical techniques used in these new omic sciences. Liquid chromatography mass spectrometry, time-of-flight data, and Fourier transform mass spectrometry are but a selection of the measurement platforms available to the modern analyst. Thus in practical proteomics or metabolomics, researchers will not only be confronted with new high dimensional data types—as opposed to the familiar data structures in more classical genomics—but also with great variation between distinct types of mass spectral measurements derived from different platforms, which may complicate analyses, comparison, and interpretation of results.
Author: Jérémy Jeudy
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Languages : fr
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Book Description
Le travail présenté ici s'est penché sur les problèmes rencontrés sur ce type d'études protéomiques, et sur les solutions qui peuvent être explorées pour améliorer le débit d'évaluation des candidats biomarqueurs. Les peptides à méthionine sont généralement évités en raison de leur sensibilité à l'oxydation. Cependant, il semblait intéressant d'étudier leur modification endogène pouvant affecter les processus biologiques. Une première évaluation de l'impact de l'oxydation des apolipoproteins dans le cas de la maladie d'Alzheimer, a permis de mettre de côté ce biomarqueur potentiel, et de faire apparaître un certain nombre de problèmes liés au prélèvement et au stockage des échantillons biologiques. L'évaluation de dispositifs DBS (Dried Blood Spot) et Vivid à partir d'un panel de 32 protéines sanguines a permis de fournir une première solution envisageable pour maîtriser ces problèmes. Par la suite, un nouveau mode de quantification des peptides appelé MRM3 a été utilisé pour dépasser la complexité de la matrice biologique, et fournir une évaluation fiable des niveaux de concentration de 2 protéines plasmatiques, la C-Reactive protein et la TIMP-1, ainsi que 2 protéines urinaires, l'aquaporin-2 et la podocin. Pour améliorer la sensibilité d'analyse et réduire les coûts de solvants nécessaires aux analyses, l'évaluation d'une plate-forme de micro-chromatographie a été réalisée par comparaison à une plate-forme narrow-bore. Cette étude a permis de mettre en évidence l'impact important de l'effet matrice sur le processus analytique, nécessitant de développer de nouvelles stratégies de travail. Enfin, afin de réduire la complexité de l'échantillon, l'évaluation de cartouches d'extraction en phase solide à base de large taille de pores a été réalisé, et un protocole développé a permis d'analyser avec succès des enzymes contenus dans un échantillon de lessive commerciale. De plus, la durée nécessaire à la préparation d'échantillons biologiques a pu être fortement réduite en combinant une digestion rapide assistée par température combinée au dessalage en ligne, afin de permettre l'analyse quantitative des protéines qu'il contient seulement quelques heures après son arrivée au laboratoire.
