Développement d'un microsystème d'analyse de micro-tissus par spectroscopie diélectrique hyperfréquence pour l'évaluation en temps réel d'effets biologiques d'agents chimiques PDF Download
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Author: Olivia Peytral-Rieu
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Languages : fr
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Book Description
La spectroscopie diélectrique micro-onde représente une technique analytique prometteuse pour de nombreux champs applicatifs, biologie cellulaire notamment. Elle permet en effet d'étudier de façon non invasive et non destructive des cellules dans leur milieu de culture grâce à leurs propriétés diélectriques. Ceci peut être réalisé à des échelles variées, que ce soit à l'échelle de l'organe ou du tissu, de suspensions de cellules jusqu'à l'analyse de cellules individuelles. En outre, il existe une échelle intermédiaire non encore abordée avec une telle technique d'analyse, celle des micro-tissus ou encore appelés sphéroïdes, modèle biologique in vitro fortement prisé car se rapprochant des problématiques rencontrées in vivo. Il s'agit d'amas de cellules agrégées entre elles, qui présentent différents gradients, tant en composition qu'environnemental. Les cellules sont en contact les unes aux autres et forment une sphère, d'où le terme de modèle 3D ou encore de sphéroïde. Les travaux de thèse visent donc à étendre les capacités d'analyse cellulaire par spectroscopie diélectrique micro-onde à cette nouvelle échelle, celle des micro-tissus. Les travaux réalisés font suite à un premier démonstrateur développé antérieurement dans l'équipe de recherche MH2F du LAAS. Ce premier micro-capteur RadioFréquence (RF) adapté à la mesure micro-onde de sphéroïdes de 300 μm de diamètre maintenu dans leur milieu de culture par un système fluidique ouvert de type réservoir avait été conçu, fabriqué et commencé à être évalué au préalable. Outre une caractérisation plus poussée de ce composant à l'aide de multiples modèles, billes de polystyrène et sphéroïdes, pour en définir les capacités et limitations de mesure, une modélisation électrique permettant d'obtenir les paramètres diélectriques de l'objet étudié a ainsi été développée. Ainsi, après avoir introduit les sphéroïdes comme modèle biologique et les différentes techniques de caractérisation existantes de ce type de modèle dans un premier chapitre, le second chapitre est dédié à l'introduction de ce premier démonstrateur et de ses capacités d'analyse. Différentes solutions ont alors été envisagées afin de pallier ces limitations, dont le fait de rendre la configuration fluidique fermée en association à un système de blocage du sphéroïde à étudier pour un positionnement précis et donc augmenter la sensibilité de détection. Le troisième chapitre de ce manuscrit présente les développements correspondants, à savoir la conception totalement revue du composant et l'optimisation de son procédé de fabrication. Une étude de sensibilité de détection suivant le dimensionnement du capteur a également été menée numériquement et vérifiée expérimentalement. La caractérisation de sphéroïdes vivants, fixés et aussi soumis à un autre agent chimique que le paraformaldéhyde (utilisé pour la fixation), la chloroquine, a permis d'évaluer le potentiel du dispositif en vue d'une application de type criblage de médicaments. Pour réaliser cette étude, une collaboration avec l'entreprise Anti-Oxydant Power a été menée. La détection par technique RF de l'impact du changement environnemental cellulaire sur sphéroïdes pour différentes concentrations d'agent chimique appliqué donne ainsi une preuve de concept importante à l'échelle de modèle 3D de l'adéquation de cette technique de mesure pour observer des transformations cellulaires et même tissulaires, en complémentarité aux outils optiques classiques, et ce de façon non invasive et non destructive et sans besoin de marquage préalable. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives d'analyse pour évaluer la réponse biologique de tels modèles tridimensionnels soumis à des agents chimiques.
Author: Olivia Peytral-Rieu
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La spectroscopie diélectrique micro-onde représente une technique analytique prometteuse pour de nombreux champs applicatifs, biologie cellulaire notamment. Elle permet en effet d'étudier de façon non invasive et non destructive des cellules dans leur milieu de culture grâce à leurs propriétés diélectriques. Ceci peut être réalisé à des échelles variées, que ce soit à l'échelle de l'organe ou du tissu, de suspensions de cellules jusqu'à l'analyse de cellules individuelles. En outre, il existe une échelle intermédiaire non encore abordée avec une telle technique d'analyse, celle des micro-tissus ou encore appelés sphéroïdes, modèle biologique in vitro fortement prisé car se rapprochant des problématiques rencontrées in vivo. Il s'agit d'amas de cellules agrégées entre elles, qui présentent différents gradients, tant en composition qu'environnemental. Les cellules sont en contact les unes aux autres et forment une sphère, d'où le terme de modèle 3D ou encore de sphéroïde. Les travaux de thèse visent donc à étendre les capacités d'analyse cellulaire par spectroscopie diélectrique micro-onde à cette nouvelle échelle, celle des micro-tissus. Les travaux réalisés font suite à un premier démonstrateur développé antérieurement dans l'équipe de recherche MH2F du LAAS. Ce premier micro-capteur RadioFréquence (RF) adapté à la mesure micro-onde de sphéroïdes de 300 μm de diamètre maintenu dans leur milieu de culture par un système fluidique ouvert de type réservoir avait été conçu, fabriqué et commencé à être évalué au préalable. Outre une caractérisation plus poussée de ce composant à l'aide de multiples modèles, billes de polystyrène et sphéroïdes, pour en définir les capacités et limitations de mesure, une modélisation électrique permettant d'obtenir les paramètres diélectriques de l'objet étudié a ainsi été développée. Ainsi, après avoir introduit les sphéroïdes comme modèle biologique et les différentes techniques de caractérisation existantes de ce type de modèle dans un premier chapitre, le second chapitre est dédié à l'introduction de ce premier démonstrateur et de ses capacités d'analyse. Différentes solutions ont alors été envisagées afin de pallier ces limitations, dont le fait de rendre la configuration fluidique fermée en association à un système de blocage du sphéroïde à étudier pour un positionnement précis et donc augmenter la sensibilité de détection. Le troisième chapitre de ce manuscrit présente les développements correspondants, à savoir la conception totalement revue du composant et l'optimisation de son procédé de fabrication. Une étude de sensibilité de détection suivant le dimensionnement du capteur a également été menée numériquement et vérifiée expérimentalement. La caractérisation de sphéroïdes vivants, fixés et aussi soumis à un autre agent chimique que le paraformaldéhyde (utilisé pour la fixation), la chloroquine, a permis d'évaluer le potentiel du dispositif en vue d'une application de type criblage de médicaments. Pour réaliser cette étude, une collaboration avec l'entreprise Anti-Oxydant Power a été menée. La détection par technique RF de l'impact du changement environnemental cellulaire sur sphéroïdes pour différentes concentrations d'agent chimique appliqué donne ainsi une preuve de concept importante à l'échelle de modèle 3D de l'adéquation de cette technique de mesure pour observer des transformations cellulaires et même tissulaires, en complémentarité aux outils optiques classiques, et ce de façon non invasive et non destructive et sans besoin de marquage préalable. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives d'analyse pour évaluer la réponse biologique de tels modèles tridimensionnels soumis à des agents chimiques.
Author: Wenli Chen
Publisher:
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Category :
Languages : fr
Pages : 131
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Book Description
La mesure de cellules biologiques constitue une étape de routine dans de nombreuses investigations en biologie. Les techniques actuelles utilisées par les biologistes sont principalement basées sur l'utilisation marqueurs optiques de coloration ou fluorescents, qui fournissent des observations moléculaires et cellulaires très précises et efficaces. Dans ce contexte, la spectroscopie diélectrique micro-ondes pour analyse cellulaire constitue une méthode nouvelle et attrayante, en raison du manque de préparation et manipulation des cellules, sans besoin d'ajout de produits chimiques, qui pourraient interférer avec d'autres constituants cellulaires. Sa compatibilité avec l'analyse de cellules uniques, potentiellement en temps réel, constitue également deux atouts importants de la technique d'analyse. Les travaux de cette thèse ont donc porté sur l'optimisation d'un biocapteur hyperfréquence microfluidique, dédié à la spectroscopie diélectrique de cellules biologiques uniques, et au développement de sa métrologie pour accéder au comportement diélectrique de cellule soumise à des stimuli chimique. Après un état de l'art sur les techniques courantes d'analyse de cellule individuelle, nous nous sommes attachés à optimiser le biocapteur hyperfréquence pour en améliorer les performances en sensibilité et en répétabilité. Ces optimisations ont porté sur le procédé de micro-fabrication, l'architecture du composant, que ce soit au niveau mécanique vis à vis de l'efficacité de blocage d'une cellule unique, mais aussi d'un point de vue électromagnétique avec une étude paramétrique. Ces études ont été validées dans un premier temps expérimentalement par la mesure de billes de polystyrène, modèle diélectrique simplifié par rapport à la complexité d'une cellule biologique, puis sur cellules individuelles vivantes dans leur milieu de culture. Le banc de caractérisation a également été optimisé afin de permettre la mesure diélectrique de cellules au cours du temps, et notamment en réaction à un stimulus d'ordre chimique. La cinétique de réaction d'une cellule unique soumise à de la saponine a été enregistrée automatiquement pour différentes cellules. Ces travaux ouvrent ainsi la voie à l'analyse à l'échelle cellulaire par spectroscopie diélectrique micro-onde de processus biologiques complexes en temps réel.
Author: François Artis
Publisher:
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Category :
Languages : fr
Pages : 195
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Book Description
Les techniques optiques dédiées à l'analyse de cellules entières classiquement utilisées dans les laboratoires de biologie cellulaire (microscopie, cytométrie en flux), nécessitent généralement un large éventail de fluorochromes et marqueurs spécifiques afin de cibler des composés ou des fonctions cellulaires. La grande puissance informative de ces techniques optiques conventionnelles exige une ou plusieurs étapes de marquage souvent précédées d'une fixation et d'une perméabilisation de l'échantillon cellulaire. Les marquages nécessaires requièrent donc une méthodologie lourde à mettre en œuvre, ils sont complexes, souvent coûteux et systématiquement chronophages. De plus, après avoir été marquées, les cellules sont la plupart du temps altérées et leur suivi au cours du temps est alors difficile. Dans ce contexte, la spectroscopie diélectrique hyperfréquence se positionne comme une méthode pertinente ne nécessitant aucune molécule exogène pour analyser les cellules, pouvant ainsi répondre au besoin de suivre des processus biologiques au cours du temps. En effet, cette méthode exploite l'interaction champ électromagnétique/matériel biologique avec l'extraction de la permittivité relative obtenue de l'échantillon biologique d'intérêt en fonction de la fréquence du champ appliqué. De plus, les mesures sont réalisées directement dans le milieu de culture des cellules permettant des analyses sur des temps longs sans altérer l'intégrité cellulaire. Le travail mené au cours de cette thèse se situe donc à l'interface entre trois vastes domaines scientifiques que sont la biologie cellulaire, l'électronique hyperfréquence et les micro-technologies. Ce travail a nécessité une succession d'étapes de mises au point, suivant un cheminement à complexité croissante, conduisant finalement à l'obtention de signatures hyperfréquences cellulaires spécifiques. Les résultats de suivi de la mort apoptotique de cellules de lymphome B (DOHH2) induite par des agents anti-cancéreux montrent que la technique permet de distinguer des évènements à des temps plus précoces qu'avec la cytométrie en flux. La spectroscopie diélectrique hyperfréquence présente donc des capacités de détection inédites par rapport aux techniques classiques de la biologie cellulaire. Actuellement utilisée sur des lignées de lymphome B, la technique offre de nombreuses applications potentielles sur cellules de patient et on peut imaginer son intérêt pour l'évaluation de l'efficacité de diverses drogues, avec l'objectif à plus long terme de mieux adapter les thérapies anti-cancéreuses aux patients.
