Adaptation des mécanismes de résistance par efflux actif chez les souches de pseudomonas aeruginosa dans la mucoviscidose PDF Download
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Author: Lucie Vettoretti
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Bactérie opportuniste bien connue, pseudomonas aeruginosa est un acteur majeur de l'infection broncho-pulmonaire chronique qui se développe chez les patients atteints de mucoviscidose (CF). Grâce à des mécanismes complexes, ce pathogène parvient à s'implanter dans les voies respiratoires des malades et à résister aux traitements antibiotiques, même les plus agressifs. L'analyse rétrospective d'une collection de souches du laboratoire de bactériologie du CHU de Besançon a révélé chez la plupart des porteurs chroniques une diversification parfois extrême des profils de résistance au cours du temps. Les techniques de génotypage par l'analyse des microsatellites (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis), par la détection de Single Nucléotides Polymorphisms (puces Clondiag®) et par macrorestriction de l'ADN génomique (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) ont conduit à des résultats similaires pour la comparaison des isolats séquentiels provenant d'un même patient. Aucun clone n'était partagé entre les 6 patients, traduisant l'absence de contamination croisée pendant la période étudiée (1998-2006). Le plus souvent la souche de primo-colonisation évolue pour donner naissance à des sous-populations dont les niveaux de résistance fluctuent. Si certaines d'entre elles évoluent vers la mutirésistance, d'autres, au contraire, deviennent hypersensibles à certains antibiotiques. Ainsi, dans près de 30 % des cas et chez près d'un patient sur deux, les souches deviennent hypersensibles aux Béta-lactamines. Nous avons montré que ce phénotype particulier, nommé Tic HS, analysé chez 11 isolats résulte d'un déficit dans le système d'efflux actif MexAB-OprM pouvant impliquer, soit la sous-expression du gène mexB (n=2), soit la production d'une protéine MexB (n=2) ou MexA (n=1) altérée. Chez d'autres isolats (n=6), le système MexAB-OprM est à priori intact, mais non fonctionnel. Par ailleurs, dans ce travail nous avons mis en évidence, pour la première fois, que P. aeruginosa peut s'adapter in vivo à la pression exercée par les aminosides en modifiant non plus, la quantité de systèmes d'efflux produite, mais la pompe elle-même. Par exemple, la substitution F1018L dans la protéine MexY du système MexXY (OprM) entraîne une augmentation de la résistance d'un facteur 2 vis à vis des substrats de la pompe (aminosides, céfépine, fluoroquinolones). Toutefois, cette substitution n'explique qu'en partie les hauts niveaux de résistance (augmentation des CMI d'un facteur 16) conférés par le système MexXY (PprM) chez certaines souches ce qui suggère la présence de mécanismes additionnels susceptibles de moduler l'efficacité de cette pompe.
Author: Lucie Vettoretti
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Bactérie opportuniste bien connue, pseudomonas aeruginosa est un acteur majeur de l'infection broncho-pulmonaire chronique qui se développe chez les patients atteints de mucoviscidose (CF). Grâce à des mécanismes complexes, ce pathogène parvient à s'implanter dans les voies respiratoires des malades et à résister aux traitements antibiotiques, même les plus agressifs. L'analyse rétrospective d'une collection de souches du laboratoire de bactériologie du CHU de Besançon a révélé chez la plupart des porteurs chroniques une diversification parfois extrême des profils de résistance au cours du temps. Les techniques de génotypage par l'analyse des microsatellites (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis), par la détection de Single Nucléotides Polymorphisms (puces Clondiag®) et par macrorestriction de l'ADN génomique (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) ont conduit à des résultats similaires pour la comparaison des isolats séquentiels provenant d'un même patient. Aucun clone n'était partagé entre les 6 patients, traduisant l'absence de contamination croisée pendant la période étudiée (1998-2006). Le plus souvent la souche de primo-colonisation évolue pour donner naissance à des sous-populations dont les niveaux de résistance fluctuent. Si certaines d'entre elles évoluent vers la mutirésistance, d'autres, au contraire, deviennent hypersensibles à certains antibiotiques. Ainsi, dans près de 30 % des cas et chez près d'un patient sur deux, les souches deviennent hypersensibles aux Béta-lactamines. Nous avons montré que ce phénotype particulier, nommé Tic HS, analysé chez 11 isolats résulte d'un déficit dans le système d'efflux actif MexAB-OprM pouvant impliquer, soit la sous-expression du gène mexB (n=2), soit la production d'une protéine MexB (n=2) ou MexA (n=1) altérée. Chez d'autres isolats (n=6), le système MexAB-OprM est à priori intact, mais non fonctionnel. Par ailleurs, dans ce travail nous avons mis en évidence, pour la première fois, que P. aeruginosa peut s'adapter in vivo à la pression exercée par les aminosides en modifiant non plus, la quantité de systèmes d'efflux produite, mais la pompe elle-même. Par exemple, la substitution F1018L dans la protéine MexY du système MexXY (OprM) entraîne une augmentation de la résistance d'un facteur 2 vis à vis des substrats de la pompe (aminosides, céfépine, fluoroquinolones). Toutefois, cette substitution n'explique qu'en partie les hauts niveaux de résistance (augmentation des CMI d'un facteur 16) conférés par le système MexXY (PprM) chez certaines souches ce qui suggère la présence de mécanismes additionnels susceptibles de moduler l'efficacité de cette pompe.
Author: Christelle Vogne
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Pages : 167
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La résistance naturelle de P. aeruginosa à l'égard des antibiotiques majeurs dans la mucoviscidose comme les aminosides, les fluoroquinolones, le céfépime et les macrolides repose, en partie, sur le fonctionnement d'un système d' efflux actif appelé MexXY -OprM. Nous avons tout d'abord étudié le rôle de la protéine MexZ codée par un gène transcrit en amont de l'opéron mexXY. MexZ est capable de réprimer l'expression de l'opéron et de contrôler également sa propre expression. Cet auto contrôle limite la production du répresseur MexZ et permet au système d'efflux MexXY-OprM d'être exprimé à un niveau basal chez les bactéries sauvages. L'inactivation du répresseur MexZ in vitro consécutive à des mutations dans le gène mexZ chez la souche de référence P AO 1 entraîne la dérépression stable de l'opéron mexXY et une résistance de bas niveau aux aminosides, aux fluoroquinolones et au céfépime. Si les gènes mexXY sont très peu exprimés en l'absence d'antibiotique, leur surexpression peut être induite de façon transitoire par certains substrats de la pompe, tels les aminosides, la tétracycline, le chloramphénicol et les macrolides. Cette surproduction transitoire réduit l'effet bactéricide de l' amikacine chez la souche sauvage P AO 1 mais n'est par observable chez un mutant L1mexXY. L'antagonisme existant entre certains antibiotiques substrats du système MexXY-OprM est ainsi lié à la surproduction de la pompe d'efflux. L'implication du système MexXY-OprM dans le développement d'une résistance stable aux aminosides a été étudiée chez des souches cliniques isolées de patients atteints de mucoviscidose (CF). L'analyse de six souches résistantes aux aminosides révèle que toutes surproduisent MexXY à la suite de mutations inactivant le gène régulateur mexZ. La complémentation de ces souches résistantes par le gène mexZ se traduit par un retour à la sensibilité aux aminosides et aux autres substrats de la pompe MexXY -OprM. Sur quatre souches cliniques non CF résistantes aux aminosides par surproduction de MexXY, une seule présente des mutations dans le gène mexZ, suggérant fortement l'existence d'une régulation complexe de l'opéron mexXY impliquant d'autres gènes.
Author: Véronique Yvette Ntsogo Enguene
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Languages : fr
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Les pompes d'efflux sont des complexes macromoléculaires qui permettent l'efflux des antibiotiques à travers les deux membranes (interne et externe). Ces pompes, spécifiques des bactéries Gram négatif, constituent l'un des acteurs majeurs du phénomène de résistance aux antibiotiques, en contribuant ainsi à la résistance intrinsèque et acquise de ces bactéries à de nombreuses molécules utilisées en antibiothérapie. Chez P. aeruginosa, ces pompes appartiennent pour la plupart à la famille des transporteurs RND. Ce sont des complexes tripartites constitués d'un transporteur de la membrane interne (RND), d'un adaptateur périplasmique (MFP) et d'un canal de la membrane externe (OMF). Ces composants ont été caractérisés individuellement chez de nombreuses bactéries. Cependant, les mécanismes qui régissent l'assemblage et la dissociation de la pompe, essentiels pour son fonctionnement, demeurent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation biophysique du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d'ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nos résultats montrent que les OMFs de P. aeruginosa présentent des similitudes avec les OMFs d'autres bactéries Gram négatif, mais également des différences, notamment pour OprN et OprM au niveau de l'interaction avec leurs partenaires ou encore pour OprM concernant l'ouverture du canal. Nous avons par ailleurs participé à l'étude in vitro de l'assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes, confirmant l'importance de l'acylation de la MFP dans la formation du complexe et montrant l'importance de la force proto-motrice dans l'assemblage de la pompe mais pas dans sa dissociation. En parallèle de l'étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la beta-lactamase AmpC de P. aeruginosa, permettant de lier les effets fonctionnels observés à des hypothèses de modifications conformationnelles.
Author: Arnaud Bolard
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Pages : 337
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Les antibiotiques sont des molécules incontournables dans le traitement des infections bactériennes. L'émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez la pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, ont amené l'Organisation Mondiale de la Santé à déclarer indispensable le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre cette bactérie. Bien que certaines alternatives aient été envisagées, la préservation de l'activité d'antibiotiques majeurs tels que les aminosides et la colistine est primordiale. La caractérisation des mécanismes de résistance à ces médicaments est nécessaire pour la mise au point de nouvelles molécules et mieux prendre en charge les patients. Dans ce contexte, nous montrons que des mutations dans le gène fusA1 (codant le facteur d'élongation EF-G1A) et dans l'opéron pmrAB (système à deux composants PmrAB) entrainent une augmentation de la résistance aux aminosides chez des mutants isolés au laboratoire et des souches issues de patients, atteints ou non, de mucoviscidose. Certaines substitutions d'acide aminé dans EF-G1A accroissent les niveaux de résistance de 2 à 16 fois aux quatre sous-classes d'aminosides. Par ailleurs, des changements d'acide aminé dans le système à deux composants PmrAB activent l'expression des gènes PA4773-PA4774-PA4775, et la production de norspermidine et de spermidine. La synthèse de ces polyamines va de pair avec une baisse de 4 à 16 fois de la sensibilité aux aminosides à noyan 2-désoxystreptamine bisubstitué en 4,6 (gentamicine, amikacine et tobramycine). De plus, il apparaît que la résistance des mutants pmrB à la colistine est en partie dépendante de la pompe d'efflux MexXY(OprM), un système impliqué dans la résistance naturelle, adaptative ou acquise aux aminosides. Enfin, nous montrons que les mutants pmrB surproduisent des alcaloïdes contenant un motif azétidine, par une voie de synthèse non-ribosomale et dépendante du quorum sensing. Ces alcaloïdes diminuent la virulence de P. aeruginosa dans le modèle Galleria mellonella.
Author: Farid El Garch
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Pages : 339
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Bactérie opportuniste bien connue, Pseudomonas aeruginosa est responsable d'infection bronchopulmonaire chronique chez les patients atteints de mucoviscidose. Afin de mieux appréhender les mécanismes mis en jeu par la bactérie pour résister aux nombreuses cures d'antibiothérapie par les aminosides (AGs), nous avons construit une banque d'insertion chez la souche sauvage de référence PAO1. Différents mécanismes de résistance ont ainsi été caractérisés, correspondant à : (I) l'augmentation de l'efflux actif des AGs; (II) la diminution de la perméabilité de la membrane externe aux AGs ; (III) la baisse du transport actif des AGs à travers la membrane cytoplasmique et (IV) l'altération de protéines ribosomales. Chacun des mécanismes identifiés confère à la bactérie une résistance de bas niveau aux AGs. Les hauts niveaux de résistance observés chez certaines souches cliniques pourraient résulter de l'addition de plusieurs mécanismes, ce qui a été démontré chez des doubles, triples et quadruples mutants construits in vitro
Author: ISABELLE.. ZIHA ZARIFI
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Author: Georges Roche
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Languages : fr
Pages : 120
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"En utilisant un milieu de culture contenant de l'amikacine (6 mg/l), nous avons pu isoler des bactéries résistantes (...). Certaines bactéries ont montré une résistance stable. Pour d'autres, la résistance s'est avérée transitoire, suggérant un phénomène adaptatif d'efflux actif ou d'imperméabilité membranaire." (extr. résumé)
Author: Gilles Phan
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Pages : 270
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La bactérie à Gram-negatif Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste impliqué dans les infections nosocomiales et touchant essentiellement les individus immunodéprimés. Parmi les mécanismes de résistance aux antibiotiques, leur efflux actif par un système de transport transmembranaire appelé Mex (Multi-drug Efflux pump) a pris une grande importance clinique. Ces systèmes d’efflux sont constitués d’un assemblage de trois protéines différentes : une porine de la famille OMF (Outer Membrane Factor), un transporteur de la famille RND (Resistance Nodulation Division) localisé dans la membrane interne et un adaptateur périplasmique de la famille MFP (Membrane Fusion Protein) assurant la cohésion du système. Le sujet de thèse porte sur l’étude structurale, essentiellement par cristallographie RX, de la pompe d’efflux MexXY-OprM qui présente la particularité d’être spécifique aux antibiotiques de la famille des aminoglycosides.
Author: Sonia Feyrouz Sardi
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Pages : 122
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Introduction : Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste humain responsable d'infections sévères chez les patients à risques : immunodéprimés, mucoviscidose et de pathologie chroniques. Quatrième germe nosocomial mis en évidence en France, les infections à des isolats multi-résistants sont associées à une augmentation de la mortalité, de la durée d'hospitalisation et à un surcout sur le système de soins. La caractérisation de ces résistances est devenue essentielle pour garantir une prise en charge médicale efficace et prévenir la diffusion de ces résistances. A ce jour, les mécanismes de résistances diffusibles incluant les carbapénèmases et les BLSE ne sont pas recherchées dans notre laboratoire. Matériels et méthodes : Une étude rétrospective de la résistance aux bêta-lactamines était réalisée sur une période comprise entre janvier 2017 et février 2021 ; à partir de souches provenant de patients hospitalisés à l'Assistance publique des Hôpitaux de Marseille (AP-HM). En parallèle, une investigation moléculaire et phénotypique était réalisée sur une collection de 73 souches pour l'exploration des mécanismes de résistance aux béta-lactamines dont la surexpression d'ampC, l'altération de l'OprD, les bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE) et les carbapénèmases. L'étude des transporteurs d'efflux n'était pas réalisée. Résultats : L'analyse épidémiologique retrouvait une résistance aux bêta-lactamines inférieur à la résistance observée au niveau européen. La résistance aux bêta-lactamines restait élevée dans les populations à risques en comparaison aux services conventionnels. Le mécanisme majoritaire de la résistance aux bêta-lactamines identifié était la surexpression de la céphalosporinase ampC (90%). Nous n'avions pas mis en évidence de BLSE. Deux carbapénèmases ont été identifiés (IMP-15) et démontre une prévalence minoritaire mais présente dans la résistance aux carbapénèmes (10%;2/20). Enfin, la résistance aux carbapénèmes était déduite comme une altération de l'oprD par acquisition de mutation génétique dans le gène codant la porine. Conclusion : Au sein de nos hôpitaux, la résistance aux bêta-lactamines est majoritairement expliquée par des mécanismes de résistances intrinsèques. La mise en évidence de carbapénèmases et son impact au niveau de la prise en charge médicale imposent de mettre en place des mesures de dépistages des souches multi-résistantes. Une routine diagnostique dans la recherche des carbapénèmases les plus fréquentes (IMP et VIM) devrait être mis en place.
Author: Anaïs Soares
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Les infections en biofilm, notamment de dispositifs médicaux, mettent fréquemment en échec les traitements antibiotiques, imposant le retrait du matériel. Pseudomonas aeruginosa s’est imposé comme le pathogène-type des infections en biofilm. Pour explorer les déterminants de l’échec du traitement antibiotique en biofilm, un modèle de biofilm in vitro à P. aeruginosa exposé à des doses supra-inhibitrices d’antibiotiques a été développé. En culture planctonique, une bithérapie deciprofloxacine et d’amikacine permettait de prévenir la sélection de mutants résistants pour des souches de P. aeruginosa de sensibilité diminuée à la ciprofloxacine ou à l’amikacine par surexpression d’efflux. En biofilm, l’association de la ciprofloxacine et de l’amikacine, administrées simultanément ou séquentiellement, n’était pas supérieure aux monothérapies, permettant une réduction bactérienne, mais pas d’éradication complète du biofilm. Quelles que soient les souches (sauvages ou exprimant un efflux) et l’antibiotique, l’échec microbiologique en biofilm était lié à la sélection de cellules persistantes, tolérantes aux antibiotiques. La ciprofloxacine induisait des modifications importantes de la structure du biofilm avec une réduction considérable des exopolysaccharides, composants majeurs de la matrice. L’étude transcriptomique de gènes potentiellement impliqués dans la persistance suggérait que l’activation précoce de la réponse stringente pourrait être une des voies principales de la tolérance en biofilm sous ciprofloxacine. Enfin, la présence de « small colony variants » au sein du biofilm, dotés d’une capacité accrue de formation de biofilm, témoignait de la diversité des populations en biofilm. Ces travaux participent ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes d’échappement aux antibiotiques de P. aeruginosa en biofilm.
